4.2.4 VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.

A) Plásmidos: 

Son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación:

1. Pequeño tamaño que permite mayor

facilidad de aislamiento y manipulación.

2. Son circulares, lo que hace que el ADN

sea más estable durante su aislamiento quí-

mico.

3. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana.

4. Existen múltiples copias en la célula,

dependiendo del plásmido y de la especie

hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias

de pBR322 por célula).

5. La presencia de genes de resistencia

a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y

selección de los clones que los contienen.

6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido

se hace generalmente inestable.

B) Bacteriófagos o fagos:

Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucleótidos y la función de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo. La molécula resultante de ADN recombinante puede ser  empaquetada  en las cabezas del fago  in vitro.

C) Cósmidos:

Son vectores híbridos, que combinan las características ventajosas de los plásmidos

bacterianos y del fago λ. Cos proviene de sitio cohesivo («cohesive site»), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de λ maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ, que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células de  E. coli y la capacidad de empaquetamiento  in vitro del cromosoma de λ. Contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. La principal ventaja de los cósmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

D) Fásmidos (fagémidos):

Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector típico derivado de M13.

E) Cromosomas artificiales:

Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura  creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.biblioteca.org.ar/libros/150406.pdf

4.2.3 CLONACIÓN DE GENES

Dentro de la célula, la doble hélice de DNA está rodeada y enrollada por varias proteínas. Cuando un investigador intenta aislar una molécula de DNA sin proteínas, se encuentra con que tales moléculas de DNA son muy largas y muy delgadas (Típicamente, en la célula humana las moléculas de DNA tienen proporciones axiales de 1:10000) y debido a esta desproporción se rompen con mucha facilidad. El resultado neto es que si se extrae y purifica DNA por ejemplo, de 1000 células diploides idénticas, habra 2000 copias de cualquier gene pero cada una de ellas estará en un fragmento de longitud diferente, con extremos diferentes.
Este problema dificultó en gran medida el estudio de los genes por métodos químicos y bioquímicos, pues no era posible obtener cantidades preparativas de un gene en forma pura. Durante tres cuartos de siglo la genética progresó utilizando los métodos llamados hoy día métodos genéticos, a saber mutación, segregación y recombinación. A principios de la década de 1970 se descubrieron las enzimas de restricción del tipo II, que permitían cortar el DNA y producir fragmentos más fáciles de aislar y caracterizar; y una técnica conocida como Reacción en Cadena de la DNA Polimerasa o PCR fue inventada en 1983. En la actualidad los genes (de cualquier organismo) se clonan por ingenieria genética o por PCR y se estudian con facilidad extraordinaria, de la cual, no ha gozado ninguna otra macromolécula compleja. La ventaja del DNA como material de estudio no es solo técnica, pues también hay ventajas conceptuales; cuando conocemos la secuencia de un gene se conoce la secuencia del DNA e instantáneamente se puede inferir la secuencia del RNA complementario y la secuencia de la proteína, las 3 moléculas relacionadas colinealmente.

CLONACIÓN
La clonación de fragmento de DNA se efectua en tres pasos:

1. CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.
   La utilidad de las enzimas tipo II para los análisis de DNA se deriva de las siguientes cuatro propiedades importantes:

   1. Reconocen secuencias cortas (de 4 a 7 pares bases), de tal manera que la probabilidad de tener una molécula de DNA por lo menos con un sitio de reconocimiento para cualquier enzima es muy grande.
   2. Cortan siempre los mismos sitios, lo cual hace que las observaciones sean reproducibles y reales.
   3. Cortan virtualmente todos los sitios disponibles en el DNA aunque cortan unos sitios más rápidamente que otros.
   4. La mayoría de las enzimas producen DNA de dos bandas con extremos pegajosos, que son las moléculas más fáciles de ligar In Vitro.
2. UNION: Dos o más fragementos unidos pro enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:
• DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.
• Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.
• DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.
3. CLONACION: Para que la unión de dos moléculas de DNA sea de utilidad práctica, una de las dos debe ser autorreplicante, es decir, debe tener suficiente información para replicarse en alguna célula viva disponible. Plásmidos y Virus llenan esta condición pues pueden ser introducidos a células apropiadas donde se replican normalmente, junto con el DNA inserto. Se debe definir ahora algunos términos útiles:
   Vector o Vehículo: Es la molécula autorreplicante.
   Inserto: Es el fragemento de DNA "exógeno" que se liga al vector.
   Anfitrión: Es la célula empleada en la propagación del vector con su inserto, es decir, el DNA recombinante.
   Clonación molecular: Es la propagación en la célula anfitriona de las secuencias de DNA inserto. Las células con un DNA recombinante se pueden clonar.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS
Un ejemplo de vector para la construcción de cromosomas artificiales en el pYAC2 (Figura 1).

Figura 1. Cromosoma artificial de Levadura

Este plásmido tiene el Ori de E. Coli, el gen de la resistencia a Ampicilina y otras regiones cortas de pBR322. De las levaduras derivó el locus ARS1 ("Secuencia de replicación autónoma" en levaduras), el locus CEN4 (Centrómero del cromosoma 4), el locus sup4 (un alelo supresor del gen try-tRNA, que es interrumpido por corte con la enzima SmaI, el sitio de clonación); TRP1 y URA3 (Dos marcadores a lado y lado del centrómero) permiten la selección de moléculas que han adquirido ambos brazos cromosómicos del vector . Dos secuencias TEL promueven la formación de telómeros y fueron derivadas de los extremos de moléculas de rDNA del macronúcleo de Tetrahymena (un protozoario).

El cromosoma artificial pYAC2 permite la clonación, en levaduras, de fragmentos de DNA de varios cientos de kilobases que se replican y segregan en forma de cromosomas lineales artificiales. La eficiencia de la clonación es lo suficientemente alta, como para permitir la construcción de bibliotecas genómicas de organismos superiores.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la secuencia en los extremos .

Figura 2.

Reacción en cadena de la polimerasa. Una molécula de dos bandas (Flechas largas y delgadas) se denaturaliza por calor y los primers (cajas obscuras que aunque se representan como si fuesen iguales son de diferente secuencia) reaccionan con secuencias específicas a lado y lado del segemento que se va a amplificar. Los primers son extendidos por síntesis de DNA (Flechas discontinuas) con una DNA polimerasa. Estas tres reacciones representan un ciclo y este ciclo puede repetirse hasta 40 veces. En cad ciclo el número de fragmentos largos aumenta aritméticamente y el número de productos cortos (el fragmento que se desea amplificar) aumenta geométricamente. Con eficiencia perfecta en 20 ciclos el fragmento que se va amplificar ha sido amplificado (y purificado) 1000000 de veces.

Como se ilustra en la figura 2, para la amplificación por PCR de secuencias de DNA, se utilizan dos oligonucleótidos como cebadores (Primers) para dirigir una reacción en serie catalizada por una enzima DNA polimerasa. Estos oligonucleótidos tienen secuencias diferentes entre sí que son complementarias a los extremos de cada una de las cadenas de DNA que se van a amplificar. En el proceso el DNA que se va a amplificar es primero denaturalizado por alta temperatura (90 a 100ºC) en presencia de concentraciones en exceso, tanto de los dos oligonucleótidos cebadores como de los cuatro dNTPs. La mezcla de estos componentes se enfría para permitir que los oligonucleótidos cebadores se pareen por complementaridad con las respectivas secuencias blanco y por último se ejecuta la síntesis y extensión por efecto de la DNA polimerasa.
Cada ciclo de denaturización y apareamiento complementario de los oligonucleótidos cebadores y síntesis de DNA se repite muchas veces; y como los productos de un ciclo de amplificación sirven como moldes para los ciclos sucesivos, entonces en cada vuelta de amplificación se duplica la cantidad de DNA.

BIBLIOGRAFIA

• http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/metodos_estudiar_genes.html

4.2.2 ENZIMAS DE UNIÓN

La enzima utilizada para la unión de ADN es la ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena polinucleotídica. También se denomina enzima de unión de polinucleótidos. 

Las DNA Ligasas son enzimas usadas para unir dos piezas de DNA.

Las más usadas son:
o DNA ligasa del bacteriófago T4
o DNA ligasa de E. coli 

BIBLIOGRAFÍA

r http://es.scribd.com/doc/55323702/8/DNA-UNIÓN

4.2.1 ENZIMAS DE CORTE

Las enzimas de corte o de restricción son enzimas que reconocen una determinada secuencia de ADN (secuencias cortas 4-10 nt más o menos) y la cortan. Siempre reconocen la misma secuencia y siempre la cortan en el mismo sitio y de la misma forma. La mayoría de ellas son muy específicas, de modo que si en la secuencia cambia una sola base ya no la reconocen y no la cortan.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción.

BIBLIOGRAFÍA

r http://mylaboratorio.blogspot.mx/2008/11/enzimas-de-restriccin.html

4.2 CORTE Y UNIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN

CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.

UNIÓN: Dos o más fragementos unidos por enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:

o   DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.

o   Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.

o   DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.

BIBLIOGRAFÍA

r http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/metodos_estudiar_genes.html

4.1 TRANSFORMACIÓN DE ORGANISMOS

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético extraño en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo.

Básicamente el procedimiento consiste en escoger una porción de ADN en particular, la que será fragmentada por medio de una enzima llamada endonucleasa de restricción. Las enzimas reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas y los fragmentos así obtenidos se unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores (ADN al que se le insertará ADN foráneo).

El proceso de transformación fue demostrado en 1928 por Frederick Griffith, un bacteriólogo inglés, que estaba en busca de una vacuna contra la neumonía bacteriana, descubrió que una cepa no-virulenta de Streptococcus pneumoniae podía ser transformada en virulenta al exponerla a cepas virulentas que habían sido matadas con calor.

En 1944, se demostró que este principio transformante era de índole genética, cuando Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty demostraron la transferencia génica en S. pneumoniae. Avery, McLeod y McCarty llamaron a la introducción e incorporación de ADN en bacterias, transformación.

BIBLIOGRAFÍA

                           

r http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF

UNIDAD 4: ADN RECOMBINANTE