4.4 BIOÉTICA Y REVOLUCIÓN BIOTECNOLÓGICA

La bioética comprende las cuestiones éticas relacionadas con la biología, la medicina, política, filosofía y otras disciplinas relacionadas con la actividad humana. No obstante, es generalmente aceptado que la competencia de la bioética está relacionada a la aplicación de la ética en los temas de la biología.

Así, la Bioética se define como: "El estudio sistemático de los problemas de la biomedicina de carácter interdisciplinario y plural a la luz de los principios y normas morales". La bioética representa hoy, un movimiento universal de responsabilidad profesional y por su concepción de ética global, es de la incumbencia de todos los seres humanos para respetar la naturaleza, conservar los ecosistemas y favorecer la supervivencia de la biodiversidad.

El criterio fundamental que regula a la bioética es el respeto al ser humano, a sus derechos inalienables y a su bien verdadero e integral; en el campo de la salud se ocupa de las decisiones sobre la vida, apoyando la toma de decisiones bajo los principios de autonomía, beneficencia, equidad y justicia.

La revolución biotecnológica se basa en el ADN (ácido desoxirribonucleico), molécula báica en la que se encuentra toda la información genética del individuo, cuya estructura fue descubierta en 1953, siendo a partir de entonces cuando se realizan los primeros ensayos de modificación genética realizados en laboratorios ("in vitro"). Esta técnicas, que se han aplicado en agricultura, medicina, medio ambiente e industria alimentaria, permiten la transferencia de genes entre diferentes especies, además de agilizar y analizar los posibles cambios que se generan, con la finalidad de reducir el azar propio de la naturaleza. La fase de auge de los transgénicos comienza en 1994, cuando en EEUU la Food and Drug Administration (FDA, Institución oficial que regula la seguridad alimentaria y de los medicamentos) autoriza la comercialización del primer vegetal con un gen ajeno al natural de esa especie; es el tomate "FlavrSavr" de la compañía Calgene, que retrasa el ablandamiento característico del tomate. Se define OGM como "organismo, con la excepción de los seres humanos, en el que el material genético ha sido modificado de una manera que no se produce naturalmente en el apareamiento ni en la recombinación natural". (Directiva UE 2001/18/CEE). Esta alteración en el material genético se puede deber a la introducción, eliminación o modificación de sus genes. Son considerados OGM los organismos vivos capaces de reproducirse. Por ejemplo, las semillas de soja. La soja es una legumbre, utilizada como fuente proteica en alimentación animal y humana, cuya semilla puede formar nuevas plantas. Los productos derivados de los OGM, sin embargo, han sido manipulados de modo que contienen sólo material modificado genéticamente, pero no organismos vivos. El ejemplo lo tenemos en la lecitina de soja, que se obtiene a partir de sucesivos refinados del aceite contenido en las semillas de soja, utilizada principlamnete como emulgente. El término trasgénico, muy fecuentemente utilizado, es un caso particular de OGM: es el organismo en que se introducido voluntariamente genes extraños a su material genético por carecer de ellos.

BIBLIOGRAFIA

• http://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/6/6718/Transgenicos_en_los_alimentos.pdf
• http://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2008/in084g.pdf

4.3 LEGISLACIÓN

HERRAMIENTAS GENERALES

1. Agenda 21
2. Constitución
3. Convenio de la Diversidad Biológica
4. Protocolo de Cartagena
5. Ley General de Salud
6. Ley Federal de Sanidad Vegetal
7. Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas
8. Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente
9. Ley de Desarrollo Rural Sustentable
10. Ley de Bioseguridad
11. Reglamentos 
12. Normas: FITO 056, [FITO-ECOL 200?]

RECOMENDACIONES DE LA ACADEMIA MEXICANA DE CIENCIAS CON RELACIÓN AL MARCO JURÍDICO EN BIOSEGURIDAD (JULIO, 2002)

En respuesta a la solicitud del Senado de la República, la Academia Mexicana de Ciencias realizó un proceso de análisis, a través del esfuerzo de varios de sus miembros de diversas áreas. Este grupo, integrado por 40 participantes,  elaboró el documento intitulado “Bases y Recomendaciones para la Elaboración de una Ley Mexicana de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados”. Este documento fue presentado al Senado y en él se señala que la ley debiera contemplar lo siguiente:

1. Tenga como finalidad esencial, la protección del medio ambiente, de la biodiversidad y de la salud humana.
2. Su objetivo general sea establecer los mecanismos y procedimientos que permitan una adecuada y razonable evaluación de posibles riesgos del manejo de organismos genéticamente modificados y su monitoreo, de corto, mediano y largo plazo, así como el soporte necesario para adoptar medidas de seguridad.
3. Las medidas de bioseguridad que se establezcan en la normatividad deben ser compatibles con el desarrollo y el fomento de la investigación básica y aplicada en el área de la biotecnología, pues ésta es una herramienta estratégica para el desarrollo del país y también necesaria para avanzar eficientemente en el monitoreo de posibles riesgos y en la comprensión de los efectos de los OGMs en el medio ambiente y en la salud.
4. Con el propósito de avanzar en el desarrollo de una cultura nacional más amplia en los temas de la bioseguridad y los impactos de la biotecnología en la vida y el desarrollo de la nación, la Ley debe establecer mecanismos y espacios para el análisis, la discusión y la divulgación de estos temas.
5. La bioseguridad también requiere de estímulos para un desarrollo efectivo de capacidades institucionales y científicas que permitan que las decisiones se adopten con base en conocimiento y criterio científico orientados a avanzar en la evaluación y el monitoreo de riesgos.
6. Las aplicaciones de la biotecnología involucran e inciden de manera simultánea en diferentes sectores. Por ello, una Ley de bioseguridad para regular actividades y productos derivados de la biotecnología moderna no puede aspirar a resolver, mediante un solo instrumento legal, la totalidad de los aspectos de la bioseguridad. Por lo anterior, resulta conveniente crear una Ley marco de bioseguridad que contenga los principios, instrumentos y procedimientos generales para su aplicación en los sectores correspondientes y complementariamente, realizar las adecuaciones particulares y necesarias en las leyes sectoriales relevantes para lograr la congruencia general de la regulación. De esta manera, la Ley remitiría explícitamente y en forma eficaz los aspectos particulares a la legislación sectorial. La Ley debe también establecer las bases para que las dependencias competentes expidan las normas oficiales mexicanas que aborden los aspectos específicos de esta materia en constante evolución.
7. Esta Ley marco debe regular únicamente aquellos aspectos de bioseguridad relacionados con la utilización confinada, la liberación al ambiente y la comercialización de organismos genéticamente modificados, tanto para fines de investigación como industriales y comerciales, incluyendo los posibles efectos ambientales en la salud humana derivados de la liberación. Por lo anterior, el uso o consumo de OGMs, o los productos que los contengan, debe estar sujeto al control de la inocuidad de los alimentos, a cargo de la legislación y las autoridades sanitarias. Garantizar la inocuidad de los alimentos es una función básica de la salubridad general y elemento esencial de información y protección al consumidor, que debe regularse por normas a partir de la Ley General de Salud.
8. En los principios generales que se establezcan en la Ley marco de bioseguridad, debe contemplarse que, para el análisis de soluciones a problemas particulares, se deben evaluar, caso por caso, los beneficios y los posibles riesgos del uso de OGMs; este análisis deberá también incluir la evaluación de los riesgos de las opciones tecnológicas alternas para contender con la problemática específica para la cual el OGM fue diseñado. Este análisis comparativo, el cual deberá estar sustentado en la evidencia científica y técnica, en los antecedentes sobre uso, producción y consumo, será elemento fundamental para decidir, de manera casuística, sobre la utilización y en su caso, la liberación deliberada al medio ambiente de estos organismos, con el propósito de resolver problemas específicos.
9. La Ley deberá asegurar que se cuente con normatividad adecuada, para evitar la liberación accidental al medio ambiente de OGMs, provenientes de desechos de cualquier tipo de proceso donde se hayan utilizado este tipo de organismos.
10. La Ley debe precisar las competencias de las diversas dependencias que tienen que ver con la bioseguridad, y también mejorar y consolidar el funcionamiento de la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad y Organismos Genéticamente Modificados (CIBIOGEM), al igual que el fortalecimiento de los órganos consultivos científicos de la propia Comisión y de las dependencias competentes en esta materia. Los integrantes de estos cuerpos consultivos, no deberán tener ningún tipo de conflicto de interés.
11. La Ley debe tener un contenido y enfoque sustentados en orientaciones y criterios científicos favorables al monitoreo efectivo, con énfasis en la evaluación, manejo y prevención de los riesgos. Por consiguiente, es igualmente necesario que en esta Ley se evite un enfoque punitivo y apriorísticamente restrictivo y prohibitivo, así como una sobrerregulación que exceda su propósito y que obstaculice el desarrollo de la biotecnología en el país.
12. La legislación deberá, sin embargo, propiciar y asegurar los mecanismos que permitan establecer responsabilidades a quien infrinja la normatividad en el marco de la legislación vigente.
13. La investigación científica confinada sobre organismos genéticamente modificados, que se realice en instituciones o centros de investigación, debe estar regulada por la Ley marco y, adicionalmente, por normas y principios de prevención que establezcan las propias instituciones o centros que realicen la investigación.
14. La experimentación con OGMs, o con cualquier organismo para fines de la fabricación de armas biológicas, debe ser explícitamente prohibida en el territorio nacional.
15. De igual manera, es importante que en otras leyes se revisen y refuercen aspectos de la bioseguridad del manejo de otros organismos que no son OGMs y en particular los patógenos.
16. Existen otros temas relacionados con la biotecnología moderna que, si bien son de gran relevancia, deben regularse mediante normas especializadas distintas de las de bioseguridad, como es el caso de la investigación del genoma humano, el aprovechamiento de recursos genéticos, y la propiedad intelectual de los productos y procesos biotecnológicos. Igualmente el modelo y las políticas de desarrollo agropecuario e industrial, que son de gran importancia para el país, deben ser abordados en el ámbito de las políticas públicas y legislativas que les corresponden.

4.2.5.2 ANIMALES TRANSGÉNICOS

Se considera transgénico todo organismo vivo manipulado genéticamente mediante la inserción de un  gen que no forma parte de su genoma  original. Son muchas las áreas en las cuales los animales transgénicos han aportado enormes beneficios, tal el caso del sector pecuario, pero en este  artículo sólo desarrollaremos aquellas de relevancia biomédica.

Las aplicaciones de los animales transgénicos son variadas:

1. Aumentar la resistencia a enfermedades y mejorar la producción animal, creando vacas que se desarrollan en menos tiempo, ovejas con mejor calidad de lana, cerdos con carne más magra o salmones que pueden crecer dos veces más rápido de lo normal.
2. Diseñar animales knockout, en los que se sustituye un gen funcional por otro mutante no funcional con el fin de examinar los efectos que este tipo de experimento tiene sobre el animal y poder conocer la función que desempeña el gen. Los ratones son los organismos más utilizados en ingeniería genética, porque la mayoría de sus genes actúan de una forma muy parecida a la de los genes humanos.
3. Fabricar órganos de animales para transplantes, debido a que el problema de la falta de órganos humanos donantes escasea, podría usarse los transplantes de otras especies o xenotransplantes.

Los objetivos de que se modifiquen animales genéticamente son entre otros: 

1. Mejorar la resistencia a enfermedades . Aumentar el crecimiento de los animales (por ejemplo al salmón o las carpas). 
2. Destruir especies perjudiciales para el ser humano o su entorno, (por ejemplo, se pretende utilizar un gen de la medusa que activa un mecanismo de destrucción para combatir las plagas de polillas que atacan a los cultivos de algodón). 
3. La simple experimentación , (por ejemplo, el mono `Andi', al que han introducido un gen que produce una proteína que brilla bajo la luz fluorescente).

Existen 3 métodos principales para obtener animales transgénicos introduciendo ADN extraño en sus cadenas genéticas: 

• La microinyección. 
• El retrovirus. 
• Las células madre embrionarias.

Animales transgénicos con fines comerciales 

A lo largo de los siglos se han producido animales con nuevas combinaciones de genes , por reproducción mediante cruces selectivos e hibridaciones, pero los genes que se cruzaban debían pertenecer a la misma especie o especies muy parecidas . Desde los años 80, la transgénesis superó este obstáculo permitiendo a los científicos investigar la mutación de especies, para que el beneficio económico de sus productores sea mayor.

Algunos ejemplos de animales transgénicos con fines comerciales son: Mamíferos Conejos Vacas Cerdos Ovejas Cabras Aves Pollo Codorniz Peces Salmón Trucha Carpa Dorada Medaka.

Animales transgénicos con fines médicos 

También se crean animales transgénicos con fines médicos. Estos pueden servir para avanzar en el tratamiento de enfermedades para generar medicamentos de manera endógena o como donantes de órganos.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.slideshare.net/mjmorales/animales-transgnicos-1523059#btnPrevious

4.2.5.1 PLANTAS TRANSGÉNICAS

Los transgénicos son organismos a los cuales se han introducido uno o más genes provenientes de otra especie. Las plantas  transgénicas poseen genes de todas las procedencias: de otras plantas, de animales, de bacterias, de virus y de hongos, y muchas veces poseen combinaciones de ellos, ya que se necesitan armar complejos sistemas moleculares para garantizar la expresión de  los  genes  foráneos. 

              En las plantas transgénicas se han usado genes de plantas, animales y bacterias para conferirles  características puntuales como resistencia a químicos, a condiciones ambientales adversas, a insectos, etc. a los cuales se añaden genes promotores y regulares de elevada expresión (llamados convencionalmente enhancers) provenientes de virus, puesto que éstos tienen mayor capacidad de expresión que los celulares (por las características infecciosas de los virus, que hacen que el sistema de expresión tenga prioridad con su  genoma  antes  que con el de la célula) y de esta forma de garantiza que el material introducido se transcriba  y se  traduzca.

PROCEDIMIENTOS PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS

Principalmente se emplean tres métodos para introducir genes ajenos en una planta. Todos estos métodos obtuvieron por primera vez, con más o menos  éxito, plantas transgénicas en la década de los ochenta y muchas de ellas se comercializaron en los noventa.

a) El método se basa en el empleo de un vector vivo que lleve el material genético a la célula
blanco. Existen dos formas de introducir material genético por esta vía:
1) Mediante  virus genéticamente  modificados (que llevan los  genes de interés en lugar de los genes
estructurales), los cuales insertan su genoma en el DNA celular para la replicación y de esta manera se
consigue la expresión de los genes foráneos.
2) el mecanismo natural de infección de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens que introduce
un gen de su plásmido en las células de la planta infectada. Recordemos que un plásmido es un fragmento
de ADN circular y extracromosómico que suele contener información no vital para la  bacteria  y cuyo
tamaño es del orden del 1 al 3% del cromosoma bacteriano. Este gen se integra en el genoma de la planta
provocándole un tumor o agalla. Lo que se hace con A. tumefasciens, es crear una cepa recombinante de
ésta (con los genes de interés) y se induce la formación de tumores, en los cuales se encuentran células
modificadas por la interacción, se aíslan estas células y a partir de ellas se genera el individuo transgénico
(Fig 5). Se aplicó con éxito por primera vez en 1984 en el tabaco y el girasol. Las gramíneas y en general
todas las monocotiledóneas presentan gran resistencia a  Agrobacterium por  lo cual este método es
bastante inviable en un extenso grupo de plantas de gran importancia económica.
                       

Figura 5: Resumen del proceso de DNA recombinante para crear plantas transgénicas
                                                                                                                                                                                       
   
b) Otro método empleado para transformar genéticamente plantas es el uso de protoplastos, que son células vegetales a las que se les ha liberado de la pared celular. De esta manera queda eliminada la barrera principal para la introducción de genes foráneos. Mediante esta técnica se consiguió por primera vez cereales transgénicos en 1988. Puede realizarse una transferencia directa de genes mediante la fusión de protoplastos (la célula vegetal sin la pared) mediante químicos como el PEG (polietilenglicol),  de donde se obtienen híbridos nucleares y luego células transgénicas por  recombinación;  para  este  in también puede emplearse liposomas.

c)  La biolística es  otro  método  difundido,  consiste en bombardear las células con partículas metálicas microscópicas recubiertas del DNA que se desea introducir. Si bien esta técnica ha dado buenos resultados, tiene un componente aleatorio de efecto muy fuerte que da un amplio margen a resultados impredecibles y un incremento significativo en la tasa de mutación celular. Igualmente costosos, pero con menos problemas de efecto aleatorio, están los métodos de inyección (micro  y macroinyección),  estos métodos consisten en inyectar el material genético foráneo al núcleo de la célula mediante  equipo sofisticado. Los métodos de microinyección tienen mayor eficacia que los de macroinyección por la focalización  dirigida  de  la inserción. Adicionalmente se emplean otros métodos directos como la transformación del polen y la electroporación, pero no son ampliamente utilizados. Microcañón o cañón de partículas que consiste en bombardear tejidos de la planta con micropartículas metálicas cubiertas del fragmento de ADN que interesa se integre en el ADN de la planta. Es el procedimiento que más éxitos ha conseguido y el que promete más avances.


Beneficios de las plantas transgénicas 

          Resistencia a insectos
          Resistencia a herbicidas
          Mejora de la productividad y producción
          Mejora de la calidad nutritiva
          Control de enfermedades virales
          Tolerancia al estrés ambiental
          Producción de frutos más resistentes
          Producción de plantas bioreactoras
          Fijación de nitrógeno
          Mejora con fines ornamentales
          Producción de fármacos y vacunas

 Desventajas de las plantas transgénicas 

          Los insecticidas Bt y similares
          Producción de súper plagas
          Resistencia a antibióticos
          Inestabilidad genética
          Interación ecológica negativa
          Riesgo a la biodiversidad
          Transferencia horizontal de genes
          Aparición de alergias
           Medio ambiente

BIBLIOGRAFÍA

• http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/TrinidadSanchez.pdf

4.2.5 TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE EN LA AGRICULTURA

Hasta las postrimerías de 1970, el ADN era una molécula que presentaba  amplias dificultades para su análisis bioquímico. Su gran longitud y  monotonía hacían  que  la secuencia de nucleótidos pudiese sólo ser estudiada  mediante mecanismos  indirectos. Para esto se recurría a la determinación de la secuencia de las proteínas o del  ARN.  

La tecnología del ADN recombinante constituye una suma de técnicas siendo las más 

importantes: 

1. La  rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales. 
2. La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica. 
3.  La  hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos. 
4. La  clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas. 
5.  La  ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos.

BIBLIOGRAFIA

• http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r73852.PDF

4.2.4 VECTORES DE CLONACIÓN

Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.

A) Plásmidos: 

Son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación:

1. Pequeño tamaño que permite mayor

facilidad de aislamiento y manipulación.

2. Son circulares, lo que hace que el ADN

sea más estable durante su aislamiento quí-

mico.

3. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana.

4. Existen múltiples copias en la célula,

dependiendo del plásmido y de la especie

hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias

de pBR322 por célula).

5. La presencia de genes de resistencia

a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y

selección de los clones que los contienen.

6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido

se hace generalmente inestable.

B) Bacteriófagos o fagos:

Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucleótidos y la función de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo. La molécula resultante de ADN recombinante puede ser  empaquetada  en las cabezas del fago  in vitro.

C) Cósmidos:

Son vectores híbridos, que combinan las características ventajosas de los plásmidos

bacterianos y del fago λ. Cos proviene de sitio cohesivo («cohesive site»), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de λ maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ, que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células de  E. coli y la capacidad de empaquetamiento  in vitro del cromosoma de λ. Contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. La principal ventaja de los cósmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

D) Fásmidos (fagémidos):

Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector típico derivado de M13.

E) Cromosomas artificiales:

Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura  creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.biblioteca.org.ar/libros/150406.pdf

4.2.3 CLONACIÓN DE GENES

Dentro de la célula, la doble hélice de DNA está rodeada y enrollada por varias proteínas. Cuando un investigador intenta aislar una molécula de DNA sin proteínas, se encuentra con que tales moléculas de DNA son muy largas y muy delgadas (Típicamente, en la célula humana las moléculas de DNA tienen proporciones axiales de 1:10000) y debido a esta desproporción se rompen con mucha facilidad. El resultado neto es que si se extrae y purifica DNA por ejemplo, de 1000 células diploides idénticas, habra 2000 copias de cualquier gene pero cada una de ellas estará en un fragmento de longitud diferente, con extremos diferentes.
Este problema dificultó en gran medida el estudio de los genes por métodos químicos y bioquímicos, pues no era posible obtener cantidades preparativas de un gene en forma pura. Durante tres cuartos de siglo la genética progresó utilizando los métodos llamados hoy día métodos genéticos, a saber mutación, segregación y recombinación. A principios de la década de 1970 se descubrieron las enzimas de restricción del tipo II, que permitían cortar el DNA y producir fragmentos más fáciles de aislar y caracterizar; y una técnica conocida como Reacción en Cadena de la DNA Polimerasa o PCR fue inventada en 1983. En la actualidad los genes (de cualquier organismo) se clonan por ingenieria genética o por PCR y se estudian con facilidad extraordinaria, de la cual, no ha gozado ninguna otra macromolécula compleja. La ventaja del DNA como material de estudio no es solo técnica, pues también hay ventajas conceptuales; cuando conocemos la secuencia de un gene se conoce la secuencia del DNA e instantáneamente se puede inferir la secuencia del RNA complementario y la secuencia de la proteína, las 3 moléculas relacionadas colinealmente.

CLONACIÓN
La clonación de fragmento de DNA se efectua en tres pasos:

1. CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.
   La utilidad de las enzimas tipo II para los análisis de DNA se deriva de las siguientes cuatro propiedades importantes:

   1. Reconocen secuencias cortas (de 4 a 7 pares bases), de tal manera que la probabilidad de tener una molécula de DNA por lo menos con un sitio de reconocimiento para cualquier enzima es muy grande.
   2. Cortan siempre los mismos sitios, lo cual hace que las observaciones sean reproducibles y reales.
   3. Cortan virtualmente todos los sitios disponibles en el DNA aunque cortan unos sitios más rápidamente que otros.
   4. La mayoría de las enzimas producen DNA de dos bandas con extremos pegajosos, que son las moléculas más fáciles de ligar In Vitro.
2. UNION: Dos o más fragementos unidos pro enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:
• DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.
• Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.
• DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.
3. CLONACION: Para que la unión de dos moléculas de DNA sea de utilidad práctica, una de las dos debe ser autorreplicante, es decir, debe tener suficiente información para replicarse en alguna célula viva disponible. Plásmidos y Virus llenan esta condición pues pueden ser introducidos a células apropiadas donde se replican normalmente, junto con el DNA inserto. Se debe definir ahora algunos términos útiles:
   Vector o Vehículo: Es la molécula autorreplicante.
   Inserto: Es el fragemento de DNA "exógeno" que se liga al vector.
   Anfitrión: Es la célula empleada en la propagación del vector con su inserto, es decir, el DNA recombinante.
   Clonación molecular: Es la propagación en la célula anfitriona de las secuencias de DNA inserto. Las células con un DNA recombinante se pueden clonar.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURAS
Un ejemplo de vector para la construcción de cromosomas artificiales en el pYAC2 (Figura 1).

Figura 1. Cromosoma artificial de Levadura

Este plásmido tiene el Ori de E. Coli, el gen de la resistencia a Ampicilina y otras regiones cortas de pBR322. De las levaduras derivó el locus ARS1 ("Secuencia de replicación autónoma" en levaduras), el locus CEN4 (Centrómero del cromosoma 4), el locus sup4 (un alelo supresor del gen try-tRNA, que es interrumpido por corte con la enzima SmaI, el sitio de clonación); TRP1 y URA3 (Dos marcadores a lado y lado del centrómero) permiten la selección de moléculas que han adquirido ambos brazos cromosómicos del vector . Dos secuencias TEL promueven la formación de telómeros y fueron derivadas de los extremos de moléculas de rDNA del macronúcleo de Tetrahymena (un protozoario).

El cromosoma artificial pYAC2 permite la clonación, en levaduras, de fragmentos de DNA de varios cientos de kilobases que se replican y segregan en forma de cromosomas lineales artificiales. La eficiencia de la clonación es lo suficientemente alta, como para permitir la construcción de bibliotecas genómicas de organismos superiores.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR

La reacción en cadena de la polimerasa se usa para amplificar por síntesis un segmento limitado de DNA del cual se conoce la secuencia en los extremos .

Figura 2.

Reacción en cadena de la polimerasa. Una molécula de dos bandas (Flechas largas y delgadas) se denaturaliza por calor y los primers (cajas obscuras que aunque se representan como si fuesen iguales son de diferente secuencia) reaccionan con secuencias específicas a lado y lado del segemento que se va a amplificar. Los primers son extendidos por síntesis de DNA (Flechas discontinuas) con una DNA polimerasa. Estas tres reacciones representan un ciclo y este ciclo puede repetirse hasta 40 veces. En cad ciclo el número de fragmentos largos aumenta aritméticamente y el número de productos cortos (el fragmento que se desea amplificar) aumenta geométricamente. Con eficiencia perfecta en 20 ciclos el fragmento que se va amplificar ha sido amplificado (y purificado) 1000000 de veces.

Como se ilustra en la figura 2, para la amplificación por PCR de secuencias de DNA, se utilizan dos oligonucleótidos como cebadores (Primers) para dirigir una reacción en serie catalizada por una enzima DNA polimerasa. Estos oligonucleótidos tienen secuencias diferentes entre sí que son complementarias a los extremos de cada una de las cadenas de DNA que se van a amplificar. En el proceso el DNA que se va a amplificar es primero denaturalizado por alta temperatura (90 a 100ºC) en presencia de concentraciones en exceso, tanto de los dos oligonucleótidos cebadores como de los cuatro dNTPs. La mezcla de estos componentes se enfría para permitir que los oligonucleótidos cebadores se pareen por complementaridad con las respectivas secuencias blanco y por último se ejecuta la síntesis y extensión por efecto de la DNA polimerasa.
Cada ciclo de denaturización y apareamiento complementario de los oligonucleótidos cebadores y síntesis de DNA se repite muchas veces; y como los productos de un ciclo de amplificación sirven como moldes para los ciclos sucesivos, entonces en cada vuelta de amplificación se duplica la cantidad de DNA.

BIBLIOGRAFIA

• http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/metodos_estudiar_genes.html

4.2.2 ENZIMAS DE UNIÓN

La enzima utilizada para la unión de ADN es la ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra cadena polinucleotídica. También se denomina enzima de unión de polinucleótidos. 

Las DNA Ligasas son enzimas usadas para unir dos piezas de DNA.

Las más usadas son:
o DNA ligasa del bacteriófago T4
o DNA ligasa de E. coli 

BIBLIOGRAFÍA

r http://es.scribd.com/doc/55323702/8/DNA-UNIÓN

4.2.1 ENZIMAS DE CORTE

Las enzimas de corte o de restricción son enzimas que reconocen una determinada secuencia de ADN (secuencias cortas 4-10 nt más o menos) y la cortan. Siempre reconocen la misma secuencia y siempre la cortan en el mismo sitio y de la misma forma. La mayoría de ellas son muy específicas, de modo que si en la secuencia cambia una sola base ya no la reconocen y no la cortan.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción.

BIBLIOGRAFÍA

r http://mylaboratorio.blogspot.mx/2008/11/enzimas-de-restriccin.html

4.2 CORTE Y UNIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN

CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.

UNIÓN: Dos o más fragementos unidos por enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:

o   DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.

o   Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.

o   DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.

BIBLIOGRAFÍA

r http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/metodos_estudiar_genes.html

4.1 TRANSFORMACIÓN DE ORGANISMOS

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético extraño en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo.

Básicamente el procedimiento consiste en escoger una porción de ADN en particular, la que será fragmentada por medio de una enzima llamada endonucleasa de restricción. Las enzimas reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas y los fragmentos así obtenidos se unen a otras moléculas de ADN que sirven de vectores (ADN al que se le insertará ADN foráneo).

El proceso de transformación fue demostrado en 1928 por Frederick Griffith, un bacteriólogo inglés, que estaba en busca de una vacuna contra la neumonía bacteriana, descubrió que una cepa no-virulenta de Streptococcus pneumoniae podía ser transformada en virulenta al exponerla a cepas virulentas que habían sido matadas con calor.

En 1944, se demostró que este principio transformante era de índole genética, cuando Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty demostraron la transferencia génica en S. pneumoniae. Avery, McLeod y McCarty llamaron a la introducción e incorporación de ADN en bacterias, transformación.

BIBLIOGRAFÍA

                           

r http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF

UNIDAD 4: ADN RECOMBINANTE

3.5.2.3 CRYOCONSERVACIÓN DEL GERMOPLASMA

La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

El elemento fundamental de la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.

Existen dos métodos de conge-lación. Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.

o   El método de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470], consiste en someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10 ºC hasta –30 ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede realizarse bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5 ºC/5 min), o bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este último sistema mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura aparentemente continua.

o   En el método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.

Para evitar los daños celulares se recurre generalmente al uso de crioprotectores. Los crioprotectores son sustancias de diferente composición (DMSO, glicerol o etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar, protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir, van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular. Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los procedimientos en que se utilizan crioprotectores, el material se somete frecuentemente a pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la vitrificación. El método de encapsulación-desecación fue desarrollado por primera vez por Fabre y cols. [1991, Cryoletters 11: 413-426] para ápices de Solanum plureja y consiste básicamente en envolver el material en una cuenta de alginato y, posteriormente, someterlo a desecación, como por ejemplo, usando gel de sílice, antes de introducirlo en el NL. En el método de vitrificación [Sakai y cols., 1990, Cryobiology 27: 657; Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470; Sakai y cols., 1991, Plant Science 74: 243-248] se utilizan combinaciones de agentes protectores, como DMSO, glicerol y etilenglicol, a diferentes concentraciones para proteger el material, ya que las combinaciones de agentes protectores son más eficaces que la utilización de cualquier agente en solitario. Una de las mezclas más utilizadas es: DMSO al 1 %, etilenglicol al 1 %, y glicerol al 30 %, o bien, DMSO al 5 o 10%, glicerol al 5 o 10 % y sacarosa.

Bibliografia

• http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm

3.5.2.2 SUPRESIÓN DEL CRECIMIENTO

Como se discutió antes, siempre existe un riesgo, mayor o menos, de inestabilidad citogenética cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemos, yemas y cultivos derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la temperatura baja. Con forme se reduce la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar a un estado de suspensión animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 °C; a esta temperatura, los procesos biológicos han cesado y las posibles causas de inestabilidad se habrán, por tanto, minimizado o eliminado.

Bibliografia

1. http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.2.1 FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO

Hay dos sistemas básicos de conservación del germoplasma in vitro, uno mediante la limitación del crecimiento hasta tasas mínimas, y otro mediante la supresión total del crecimiento y del metabolismo celular.

Limitación del crecimiento

El método consiste en mantener los cultivos (yemas, plántulas derivadas de nudos o directamente de meristemos) en condiciones físicas (factores ambientales) o químicas (composición del medio de cultivo) que permitan extender al máximo el intervalo de trasferencia a los medios frescos, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.

La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los siguientes factores: temperatura, nutrimentos inorgánicos y orgánicos, reguladores del crecimiento y concentración osmótica del medio.

ü  Temperatura: La mayoría de los cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas entre 20 °C y 30 °C.

ü  Concentración de nutrimentos: La relación entre la concentración de carbohidratos y los componentes nitrogenados del medio nutritivo. La sacarosa tiene un efecto en la viabilidad de los cultivos.

ü  Concentración de los reguladores del crecimiento: Los niveles de citoquininas y de inhibidores del crecimiento, como el acido abscísico, interaccionan con la concentración de sacarosa y con la temperatura de conservación y afectan así la viabilidad de los cultivos in vitro.

ü  Concentración osmótica: La limitación del crecimiento por causa de la concentración osmótica se debe, posiblemente, a la reducción de la absorción de agua y de nutrientes del medio.

Bibliografia

• http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5.2 MÉTODOS DE CONSERVACIÓN

Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ.

Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios.

Por otra parte, los métodos de conservación  ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas, bancos de cultivo  in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botánicos).

En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad.

A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas», como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras.

Otro método de conservación de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos.

Conservación por semillas

Conservación por cultivo in vitro

Bibliografia

• http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf 

3.5.1.4 ESTRATEGIAS

La conservación de los recursos filogenéticos mediante los métodos del cultivo in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el crecimiento de las células y de los tejidos; el objetivo es aumentar al máximo el periodo de trasferencia del cultivo o extenderlo indefinidamente. No obstante, debe realizarse, como se indico anteriormente, una evaluación científica cuidadosa de las ventajas y desventajas de una estrategia in vitro de la conservación de recursos genéticos para cada caso especifico.

Bibliografia

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3.5.1.3 ESTABILIDAD GENÉTICA

La estabilidad genética de los cultivos ha sido, durante mucho tiempo, un motivo de inquietud cuando se piensa aplicar las técnicas in vitro para la conservación del germoplasma. El material recuperado de la conservación in vitro debe representar genéticamente al material utilizado. Cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si introduce un alto riesgo de inestabilidad genética o de selección entre genotipos o de ambas cosas.

La monitoria de la estabilidad genética de los cultivos in vitro de las especies cultivadas esta adquiriendo gran interés. Se han adelantado criterios morfológicos, bioquímicos y moleculares para la detección de los cambios genéticos. Se deben desarrollar, como complemento de la evaluación de la estabilidad, técnicas electroforéticas para evaluar la variabilidad de las isozimas en muestras pequeñas de tejido obtenidas de cultivos in vitro. Además, se debe probar la monitoria que se ha hecho a esa estabilidad genética mediante técnicas moleculares, para detectar la variación del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción de ADN.

Bibliografia

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3.5.1.2 VARIABILIDAD

La evaluación de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemáticamente. En condiciones de crecimiento lento, en que el periodo de trasferencia se extiendo durante meses o años, la frecuencia de evaluación de los cultivos aumenta en comparación con la evaluación que haría al material conservado bajo nitrógeno líquido, por ejemplo. Las características más importantes que se evalúan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos derivados del ápice de yemas son: contaminación, senescencia de la hoja (razón hojas verdes/hojas muertas), numero de brotes verdes (para micro propagación adicional), numero de nudos viables (verdes) en relación con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de raíces y ocurrencia de callo.

Bibliografia

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3.5.1.1 REGENERACIÓN

La regeneración del plantas enteras basadas en los sistemas de cultivo de células es, a menudo, el paso que limita la aplicación de técnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que no se pueden propagar mediante meristemos preformados. A pesar de la capacidad que tienen para iniciar callo diversos tejidos y órganos de muchas especies cultivadas, la regeneración reproducible de plantas enteras sigue siendo problemática. La regeneración adventicia mediante la embriogénesis somática es muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de multiplicación y produce propágalos que poseen ejes de raíz y de yema. Los embriones somáticos pueden desarrollarse de células únicas y se pueden recuperar plantas con genotipos más estables.

Bibliografia

• http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.5 CONSERVACIÓN IN VITRO

3.5.1 ASPECTOS IMPORTANTES EN LA CONSERVACIÓN IN VITRO

La conservación in vitro tiene que considerarse como parte de la estrategia general de conservación de una especie vegetal; es más bien un auxiliar valioso y un suplemento de la conservación de los recursos genéticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro sería la única estrategia para conservar una especie dada. Para algunos frutales tropicales como el cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservación estaría probablemente en los bancos genéticos in vitro que se utilizan las técnicas in vitro para evaluar la variabilidad genética de la especie, y para la colección e intercambio de esta. Los cultivos de raíces y tubérculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenarían como semillas durante cortos periodos, de modo que, para ellos, los métodos in vitro serian complementarios para la conservación de genotipos específicos y para el traslado internacional de clones.

Bibliografia

1. http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo31.pdf

3.4.4 APLICACIÓN AGRONÓMICA

Aplicaciones a corto  plazo (hasta cinco años): propagaci6n vegetativa,  obtenci6n de plantas libres  de virus, intercambio  y almacenamiento de germoplasma,  rescate de embriones, cultivo  de anteras y producci6n de haploides, variaci6n somaclonal, metabolitos secundarios, hibridaci6n somática y híbridos.

Aplicaciones a mediano plazo (cinco a 10 años): Transferencia, integraci6n y expresi6n de genes, que controlan características  simples, a cultivos  de importancia econ6mica  (ingeniería genética para caracteres monogenicos).

Aplicaciones a largo  plazo (después,  del  año 2000):  Ingeniería ,genética para caracteres multigenicos, uso de plantas  transgénicas  para  la  producción  de metabolltos  secundarlos  (como bioreactores  naturales).

Bibliografia

• http://www.mag.go.cr/congreso_agronomico_ix/A01-1277-69a.pdf

3.4.3 FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

Bibliografia

1. http://www.fagro.edu.uy/~fisveg/docencia/cursos%20posgrado%20y%20optativos/curso%20de%20micropropagacion/mateoricos/Cultivo%20de%20protoplastos.pdf 

3.4.2 VARIACIÓN SOMACLONAL

La variación somaclonal se ha descrito  como la  variabilidad  genética que se produce en las  plantas derivadas de cultivo in vitro  de células somáticas (Scowcroft  y Larkin, 1982). Esta variabilidad  genética tiene  dos orígenes:

 1. la variabilidad natural ya presente  en las células somáticas antes del cultivo

 2. la  variabilidad  in vitro  inducida por los métodos  de cultivo  (Sondahl et al.,  1984; Vasil, 1990).

Las células somáticas mutadas  son eliminadas mediante la reproducción sexual y no son transmitidas a la progenie (Vasil,  1990). Sin embargo,  estas células tienen la oportunidad de dividirse  y multiplicarse cuando son colocadas in  vitro,  obteniéndose decenas de células mutadas de las cuales se pueden regenerar plantulas completas. De esta manera  puede incrementarse  la  variabilidad,  especialmente  en aquellos cultivos  cuya reproducción es  casi exclusivamente asexual. La inclusión de una presión de selección en el  medio de cultivo,  por  ejemplo toxinas, letales  pesados, antimetabolitos, herbicidas y otros,  permitiria  seleccionar efectivamente aquellas células que tienen  capacidad de crecer en estos medios adversos 0  restrictivos  y  que, posiblemente, pudieran mostrar tolerancia a los factores simulados en el medio de cultivo (Vasil, 1990). La resistencia 0 tolerancia deberá comprobarse  en el  invernadero y  finalmente en el  campo. Este procedimiento ha sido  exitoso  para aquellos~  caracteres  controlados por genes simples (monogenicos). La selección  de mutantes con características  paronomasias deseables como tolerancia  a  la  sequía,  a  la  acidez  del  suelo  y  a  enfermedades fungosas y  bacterianas  ha sido mas difícil   debido a que estos  caracteres  están bajo  control  multigenico. 

Tiempo requerido  para  el  desarrollo  de nuevas variedades  mediante variación  somaclonal

Bibliografia

1. http://www.mag.go.cr/congreso_agronomico_ix/A01-1277-69a.pdf