Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.
A) Plásmidos:
Son moléculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosómicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación:
1. Pequeño tamaño que permite mayor
facilidad de aislamiento y manipulación.
2. Son circulares, lo que hace que el ADN
sea más estable durante su aislamiento quí-
mico.
3. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana.
4. Existen múltiples copias en la célula,
dependiendo del plásmido y de la especie
hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias
de pBR322 por célula).
5. La presencia de genes de resistencia
a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y
selección de los clones que los contienen.
6. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plásmido
se hace generalmente inestable.
B) Bacteriófagos o fagos:
Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucleótidos y la función de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo. La molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro.
C) Cósmidos:
Son vectores híbridos, que combinan las características ventajosas de los plásmidos
bacterianos y del fago λ. Cos proviene de sitio cohesivo («cohesive site»), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de λ maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ, que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del cromosoma de λ. Contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. La principal ventaja de los cósmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.
D) Fásmidos (fagémidos):
Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido. Normalmente la replicación depende del plásmido, pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector típico derivado de M13.
E) Cromosomas artificiales:
Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.
BIBLIOGRAFIA
- http://www.biblioteca.org.ar/libros/150406.pdf
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