2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

1. Sales minerales: macronutrientes y micronutrientes

2. Vitaminas

3. Reguladores de crecimiento

4. Fuente de carbono

5. Otros compuestos orgánicos

6. Otros compuestos de uso específico

7. Gelificante (en su caso)

8. Suplementos de composición indefinida

9. Agua

Las funciones de estos compuestos pueden ser nutritivas sobre el desarrollo vegetal, pero también pueden tener funciones adicionales. Por ejemplo el Zn afecta a la síntesis de auxinas.

Las sales minerales, y principalmente los macronutrientes, además de tener cada una de ellas un papel determinado en la nutrición del explanto, son responsables de la salinidad final del medio, que determinará la mayor o menos capacidad de absorción de los nutrientes en función del tipo de especie que se cultive.

Los cultivos realizan algo de fotosíntesis pero su nutrición es mayoritariamente heterótrofa; necesitan de los compuestos minerales y también de la fuente de carbono.

Las hormonas que se precisan aportar suelen ser auxinas y citoquininas, sin embargo al prolongarse el tiempo de cultivo in vitro y realizarse subcultivos el explanto va adquiriendo la capacidad de sintetizar sus propias auxinas o citoquininas, dejando de requerir su aporte exógeno en el medio. A este fenómeno se le conoce como habituación.

Bibliografía

• http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm

2.1.3.2 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se definen principalmente por sus cualidades químicas, esto es, su composición; también deben definirse por sus cualidades físicas, tales como estado, salinidad, etc.

La mayoría de los medios que se utilizan tienen el nombre dado por quien los formuló; Otros surgen de modificaciones sobre los medios genéricos, que son los mas conocidos. Entre los primeros podemos citar:

1. Knudson (1946)

El primer medio conocido es el adecuado para de orquídeas. Bastante pobre en sales

Macronutrientes
(NH4)2SO4	0.5 g/l
MgSO4	0.122 g/l
Ca(NO3)2	0.694 g/l
KH2PO4	0.250 g/l
Micronutrientes
KI	0.83 mg/l
H3BO3	0.056 mg/l
MnSO4.H2O	5.68 mg/l
MoO3	0.016 mg/l
CuSO4.5H2O	0.062 mg/l
FeSO4.7H2O	25.0 mg/l

2. MS (Murashige y Skoog, 1962)

Es el medio más conocido; se elaboró tomando el cultivo in vitro de tabaco como modelo y siguiendo un procedimiento cuantitativo se determinaron las concentraciones mas adecuadas de todos los nutrientes. Es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza por tener una elevada concentración salina.. En esos casos puede recurrirse a otros medios o simplemente utilizarlo diluido (1/2 MS, 1/4 MS).

Macronutrientes
NH4NO3	1.65 g/l
KNO3	1.9 g/l
MgSO4.7H2O	0.37 g/l
CaCl2.aq	0.33 g/l
KH2PO4	0.17 g/l
Micronutrientes
KI	0.83 mg/l
H3BO3	6.2 mg/l
MnSO4.4H2O	22.3 mg/l
ZnSO4.7H20	8.6 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

3. White (1963)

Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de uso complementario al MS. Se elaboró para cultivo de raíces de tomate.

Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O	0.3 g/l
KNO3	0.08 g/l
MgSO4.7H2O	0.72 g/l
Na2SO4	0.2 g/l
NaH2PO4.H2O	0.019g/l
Micronutrientes
KCl	65 mg/l
KI	0.75 mg/l
H3BO3	1.3 mg/l
MnSO4.7H2O	7 mg/l
ZnSO4.7H20	3 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

4. B5 (Gamborg, 1970-1976)

Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios, a los que dio diferentes números. EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.

Macro
(NH4)2SO4	0.134 g/l
KNO3	2.528 g/l
MgSO4.7H2O	0.246 g/l
CaCl2.aq	0.15 g/l
KH2PO4	0.15 g/l
Micro
KI	0.75 mg/l
H3BO3	3.0 mg/l
MnSO4.H2O	10 mg/l
ZnSO4.7H20	2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

5. WPM (Lloyd y McCown 1980)

Se elaboró para el cultivo de tallos de plantas leñosas y arbustivas, tipos de plantas para las que está especialmente adaptado

6. KM8p (Kao y Michayluk 1982)

Kao y Michayluk abordaron la dificultad de lograr la viabilidad los protoplastos cultivados in vitro, hasta entonces muy limitada, desde el punto de vista de la optimización del medio, y formularon varios; el más exitoso fue el KM8p. Su característica principal y distintiva de los medios hasta entonces formulados es la gran diversidad de nutrientes que contiene, muchos de ellos no esenciales para el desarrollo de las plantas, pero que si han resultado limitantes en el cultivo de sus protoplastos.

Bibliografía

• http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm

2.1.3.1 DEFINICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Es una solución liquida o gelatinosa que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de células o tejidos vegetales. En donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in  vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento.

Bibliografía

www.slideshare.net/guest5e31b0e1/medios-de-cultivo

2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

l  COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES:

–       Fuente de carbono orgánico.

l  El más común la sacarosa, también mono y disacáridos como glucosa, fructosa, maltosa y lactosa.

–       Fuente de nitrógeno.

l  Nitratos, a veces también sales amónicas.

l  Algunas células necesitan nitrógeno orgánico en aminoácidos.

–       Sales orgánicas.

–       Reguladores del crecimiento.

l  Hormonas vegetales (auxinas, que inducen la división celular).

l  Citoquininas (Regulación del crecimiento en plantas).

 Bibliografía

http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm

2.1.2.2 EQUIPOS DE LABORATORIO

EQUIPOS DE LABORATORIO
Nombre	Instrumento	Función
Balanzas analítica		Es un instrumento delicado que se debe manejar con cuidado. Se debe consultar al instructor sobre los detalles para pesar con el modelo particular de balanza que se tenga.
Agitador magnético		Es un equipo electrónico que consta de un motor que gira en un rango de rpm (numero de giros que puede dar en un minuto sobre su eje), usualmente se encuentran agitadores con rangos de entre 100 a 1200 rpms, aunque existen de mayor numero de revoluciones.
Autoclave		Es un recipiente en el que se consigue exponer el material al esterilizar a temperaturas superiores a la ebullición del agua, gracias a aumentar la presión.
Potenciómetro		Es un instrumento que se basa en este método para determinar el voltaje entre dos terminales.
Cámara de flujo laminar		Este equipo, también conocido como vitrina estéril, es una base para trabajo con material susceptible de ser contaminado por el aire ambiental o bien de contaminar a este último.
Refrigeradores y congeladores		Su función consiste en mantener, en un ambiente controlado espacio refrigerado, diversos fluidos y sustancias, para que los mismos se conserven en buenas condiciones mientras más baja sea la temperatura, menor actividad química y biológica.

Bibliografia

• http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio 
• ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 7- 10.

2.1.2.1 MATERIAL DE LABORATORIO

ü  MATERIALES DE VIDRIO

Se caracteriza porque tiene mucha resistencia química (frente a ácidos, frente a bases...), tiene mayor resistencia que el plástico, es muy estable, se caracteriza por su transparencia. Todos los vidrios no son perfectos para todas las técnicas, a veces se necesitan vidrios con resistencia técnica, con resistencia mecánica. Según el uso que le queramos dar aparecen vidrios especiales. La mayoría de los utilizados son vidrios boro silicatados, los cuales ofrecen gran resistencia térmica (vidrio pirex, quimax).Cuando se emplea el material de vidrio hay que tomar unas precauciones:



•No los podemos someter a cambios bruscos de temperatura (se provocan tensiones que pueden romper el cristal).

•Hay que colocar la estufa de secado o esterilización enfrío, ir calentándolo después, y cuando acaba el tiempo de secado dejar enfriar el material

•No se debe aplicar fuerza sobre llaves, tapones de vidrio

•No se debe someter a variaciones bruscas de presión

•No se debe conservar soluciones concentradas de bases en material de vidrio de boro silicato, porque son substancias muy cáusticas que pueden destruir la calibración del aparato.

MATERIAL DE VIDRIO
Nombre	Instrumento	Uso
Matraz Erlenmeyer		Es un recipiente no calibrado, son vasijas de fondo plano con un cuello corto, se utilizan para evitar que se pierda material cuando hay reacciones de efervescencia porque la parte alta del matraz actúa como un condensador de los vapores y se retarda la evaporación. Se utiliza también para contener las disoluciones para su valoración.
Vaso de precipitado		Los vasos de precipitados son recipientes no calibrados, son anchos, las paredes son rectas, y llevan un pico para verter fácilmente los líquidos, se utilizan para preparar disoluciones, para preparar reactivos o para contener sustancias.
Matraz aforado		Se utilizan para preparar disoluciones de concentración conocida, o para diluir muestras.
Tubos de ensayo		Son unos vasos tubulares que sirven para calentar, hacer reacciones en ellos, y los puede haber de muchas formas con/sin tapón, con/sin   graduación, múltiple uso/desechables, vidrio/plástico... Usaremos vidrio/plástico dependiendo de la utilización que le queramos dar.
Pipeta		Se utilizan para transferir líquidos, y las puede haber de distintas capacidades, al igual que los matraces, llevan gravadas en sus probetas la temperatura y la capacidad a la que se debe utilizar, en la parte posterior lleva un código para el volumen, para la precisión que tengan, y además hay distintos tipos de pipetas según su función.
Probeta		Son recipientes graduados, cilíndricos, con una base para la sujeción en la parte de abajo, se utiliza para medir volúmenes que precisan poca precisión. Se utilizan para dispensar, tienen un pico en la parte de arriba para facilitar su vertido.
Bureta		Son muy utilizadas en el análisis volumétrico, se utilizan sobre todo para valorar disoluciones cuya concentración no conocemos.
Cajas de petri		Se utiliza en los laboratorios principalmente para el cultivo de cristales, en los laboratorios de biología se utilizan para el cultivo de bacterias o microorganismo.
Porta objetos		El portaobjetos es una lámina rectangular de vidrio muy delgada, donde se colocan objetos de mínimo tamaño o preparaciones de baja escala, las cuales van a ser observadas en el microscopio.

ü  MATERIALES DE PLASTICO

Los materiales de plástico pueden ser de uso múltiple, p ej. Las probetas, matraces, vasos de precipitados, las placas de petri. El plástico ofrece algunas ventajas frente al vidrio, es resistente a la rotura, tienen un peso bajo. Los utensilios de plástico de laboratorio son monómeros orgánicos polimerolarizadas. Hay gran variedad de plásticos, van a tener distintas propiedades físicas y químicas (por ejemplo, poliestireno, PVC, polipropileno...).Cuando se utiliza un plástico hay que tener en cuenta el tipo de plástico que se emplea porque algunos plásticos pueden ser atacados por disolventes.

MATERIAL DE PLASTICO
Nombre	Instrumento	Uso
Frascos lavadores		Contienen agua destilada, suelen ser de plástico flexible y terminan en un tubo flexible que permiten dirigir el chorro.
Micropipeta		Son pipetas que se utilizan para transferir cantidades muy pequeñas (1- 500 μl) se les conoce como pipetas de tipo landa= microlitro)El tipo más frecuente de micropipetas utilizadas ahora sonlas de tipo Eppendorf porque: •Proporcionan mayor  precisión •Facilita el trabajo,sobre todo en tareas.

ü  MATERIALES DE PORCELANA

Es el material que menos se usa en el laboratorio clínico, se utiliza cuando se necesitan materiales que resistan altas temperaturas, estos materiales suelen estar vidriados en el interior, para evitar que se adhieran partículas a su superficie, se utilizan sobre todo en el análisis gravimétrico orgánicos, por ácidos, por bases, además pocos plásticos pueden superar temperaturas altas.

Bibliografía

• http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

Para el desarrollo de la investigación y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro. Es muy importante que los materiales y equipos de uso común en el laboratorio se identifiquen por su nombre correcto y uso especifico que tiene cada uno, pero más importante es saber manejarlo correctamente en el momento oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que así lo requieran.