2.2 ESTERILIZACIÓN

La esterilización es un proceso a través del que se logra la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. 

Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: 

• La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. 

• El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología. 

• La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.) 

• La descontaminación de material utilizado.

Bibliografía

• http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_M%C3%A9todos_de_esterilizaci%C3%B3n.pdf

2.1.6 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo. El medio de cultivo está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener, una planta completa, o un órgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algún agente gelificante.

PROCEDIMIENTO 

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado. 

2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes.  Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo. 

3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.  

Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar. 

4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C).  

Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N. 

5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor. 

6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución 

y fecha de preparación. 

     

Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.

Ejemplo: Preparar 500 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x, añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.

Formula para utilizar ciertos ml de la solución de 50x y verterlo para hacer 500 ml.

Datos		Sustitución
V1	500 ml	V2: V1 C1/C2; V2: 500 ml x 1x / 50x= 10 ml de solución stock
C1	1x
V2	¿
C2	50x
Phytagel	2.8 g/L	2.8 g/L x 500 ml / 1000 ml= 1.4 g/500 ml
Sacarosa	30 g/L	30 g/L x 500 ml / 1000 ml= 15 g/500 ml

Después de haber agregado las 5 soluciones stock en el matrazas. se agrega después la sacarosa agregando 100 ml de agua, con forme se agrega la sacarosa. Después aforar a 500 ml, después se regula el pH entre 5.6 y 5.8 utilizando HCL o KOH para subir o bajar el ph. después se agrega el Phytagel, se calienta a 40 °C, Aquí puede agregarse el Phytagel, se deja hervir por 2 minutos, después se saca y enfría poco a poco y se agrega a cada frasco con una cantidad a 20 ml.

2.1.5 PREPARACIÓN Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

Se denomina solución madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales están formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace más rápida la futura preparación de medios y minimiza los errores, ya que La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración.

Componentes de soluciones madres o stock

Componente	Cantidad en mg/l
NH4NO3	1650
KNO3	1900
CaCl2.2H2O	440
MgSO4.7H2O	370
KH2PO4	170
Na2 EDTA	37.3
FeSO4.7H2O	27.8
H3BO3	6.2
MnSO4.4H2O	22.3
ZnSO4.7H2O	8.6
KI	0.83
Na2MoO4.2H2O	0.25
CuSO4.5H2O	0.025
CoCl2.6H2O	0.025
Glicina	2.00
Tiamina - HCl	0.10
Piridoxina – HCl	0.50
Acido Nicotinico	0.50
MyoInositol	100
Sacarosa	30000
Agar-Agar	6000

Preparación: 

EJEMPLO DE COMO CALCULAR  LA CONCENTRACIONES DE SULFATOS PARA PREPARAR EN 200 ML.

Reactivos ü  Mg SO4 . 7 H2O ü  Mn SO4 . 4 H2O ü  Zn SO4 . 7 H2O ü  Cu SO4 . 5 H2O

Cantidad en mg/L. o   370 o   22.3 o   8.6 o   0.025

Operación para calcular el Mg SO₄ . 7 H₂O

1. - Mg SO₄ . 7 H₂O: (370 mg/L) (100x): 37,000 mg/L

Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:

(37,000 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 7400 mg/ 200 ml

                                         

Ahora se debe convertir a (g):

(7400 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 7.4 g/ 200 ml

                                         

Operación para calcular Mn SO₄ . 4 H₂0

1. - Mn SO₄ . 4 H₂O: (22.3 mg/L) (100x): 2,230 mg/L

Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:

(2230 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 446 g/200 ml        

                                         

Ahora se debe convertir a (g):

(446 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 0.446 g/ 200 ml

Operación para calcular Zn SO₄ . 7 H₂0

1. - Zn SO₄ . 7 H₂O: (8.6 mg/L) (100x): 860 mg/L

Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:

(860 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 172 mg/ 200 ml

:                                                   

Ahora se debe convertir a (g):

(172 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 0.172 g/ 200 ml

Operación para calcular Cu SO₄ . 5 H₂0

1. - Cu SO₄ . 5 H₂O: (0.025 mg/L) (100x): 2.5 mg/L

Esto es a 1 concentración de 1L, pero se busca aforar a 200 ml. Entonces:

(2.5 mg/L) (200 ml) / 1000 ml: 0.5 mg/ 200 ml               

                                    

Ahora se debe convertir a (g):

(0.5 mg/ 200 ml) (1 g) / 1000 mg: 0.0005g/ 200 ml

Después de que se tienen los cálculos, en el laboratorio, estos se pesan en la balanza analítica , se disuelven de uno en uno en agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen de 100 mL, después se afora en una probeta graduada a un volumen de 200 mL, se vierte en una botella color ámbar y se guarda en refrigeración a 4°C. 

Bibliografía 

• Solución stock/solución madre esl.proz.com…… portugués al español.. Quimica/ciencias/ ing.quim.

2.1.4.4 COMPLEJOS ORGÁNICOS

Compuestos orgánicos complejos

• Aminoácidos

• Poliaminas Su utilización es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrógeno en forma amina, producir procesos morfogénicos, etc. Suplementos de composición indefinida:

• Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maíz, raíces y rizomas)

• Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, piña, tomate, patata, leche de coco)

• Caseína hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composición precisa del extracto añadido, pueden resultar útiles sólo en casos concretos.

Compuestos específicos:

• Antioxidantes: ácido cítrico, ácido ascórbico

• Adsorbentes: carbón activo

• Controladores del potencial osmótico: polietilen-glicol, manitol Se puede precisar su aporte a los medios en condiciones concretas.

Bibliografía 

• http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm

2.1.4.3 MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

GELIFICANTES

El gelificante suele ser un sólido que al añadirse a un medio de cultivo se disuelve por calentamiento fuerte (cercano a los 100 ºC) y hace que el medio adquiera la consistencia de gel al enfriarse a temperaturas menores. Uno de los mejores agentes gelificantes de que se dispone para realizar cultivos in vitro de tejidos vegetales es el agar, también conocido como agar-agar. 

Los gelificantes deben cumplir con una serie de requisitos: no ser asimilado por el explanto, lo que haría que al consumirse el medio retornase a su estadio líquido, no interferir en la absorción de los nutrientes del medio de cultivo, y permanecer estable durante el tiempo de cultivo.

Entre los compuestos alternativos al agar para utilizarse como gelificantes en el cultivo in vitro de tejidos vegetales tenemos:

• Alginatos. Excelentes para cultivo de células en suspensión y de protoplastos.

• Agarosa. Es uno de los polímeros del agar, obteniéndose a partir de él. Se utiliza más en electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos que en cultivo in vitro.

• Fitagel. Conocido también con el nombre gelrita, marca registrada de Merck; es de amplio uso.

• Ficoll. Es un derivado de polisacáridos que produce medios de cultivo de tipo coloidal. Encuentra una aplicación importante en el cultivo de anteras.

El fitagel es un polisacárido aniónico obtenido por fermentación bacteriana. El gel qué forma se caracteriza principalmente por:

• Gran transparencia, que facilita el seguimiento del cultivo.

• El medio nutritivo se gelifica con un aporte de fitagel de tan sólo el 0.2%

• Precisa de cationes divalentes para su gelificación, principalmente Mg o el Ca.

• Se disuelve y gelifica en respuestas a cambios de temperaturas, como el agar, si bien no es termoreversible.

• Los explantos cultivados en medios con fitalgel absorben los nutrientes con mucha facilidad, lo que permite un crecimiento mas rápido, sin embargo la velocidad de absorción puede ser excesiva, no pudiendo incorporarse a sus estructuras y compuestos sino que quedarían en solución dentro del explanto, causando el problema conocido típicamente como hiperhidricidad, frecuente en cultivos de tipo leñoso.

2.1.4.2 COMPUESTOS ORGÁNICOS

• Auxinas: ácido indol-acético (IAA), ácido naftalen-acético (NAA), ácido indol-butirico (IBA), ácido 2,4-Dicloro-fenoxi-acético (2,4-D) 

• Citoquininas: benciladenina (BA), quinetina (KIN) 

• Giberelinas: ácido giberélico (GA3) 

• Ácido abscísico (ABA) 

Otros reguladores del desarrollo vegetal 

De entre ellos es frecuente la adición de auxinas y citoquininas, en diferentes proporciones en función principalmente del tipo de diferenciación a inducir y del tipo de especie a cultivar. El uso de otros reguladores es mucho más ocasional. 

Hidratos de Carbono: 

• Monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa, xilosa 

• Disacáridos: sacarosa, maltosa, clobiosa, trehalosa, lactosa 

• Trisacáridos: rafinosa 

• Polisacáridos: almidón, celulosa De entre ellos el habitualmente utilizado en los medios de cultivo es la sacarosa. 

Bibliografía 

http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm

2.1.4.1 COMPUESTOS INORGÁNICOS

SALES INORGÁNICAS

Macronutrientes

· Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.

· Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.

· Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas.

· Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento.

· Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.

· Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.

· Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos.

· Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo ácido.

Micronutrientes

Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.

· Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.

· Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa

· Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2 en la fotosíntesis.

· Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.

· Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificación.

· Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

· Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

· Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis.

AGUA
Es el elementos indispensable ya que se utiliza para para aforar al volumen que se requiera.

Bibliografía

• http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm