Agrosalmir: 3.4 TECNICAS IN VITRO APLICADAS AL FITOMEJORAMIENTO

3.4.1 PRODUCCIÓN DE HAPLOIDES: CULTIVO DE ANTERAS Y ÓVULOS

Cultivo de anteras

Normalmente en la producción de haploides se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis.

Embriogénesis: se forman células (poliembriones).

Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).

Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callos. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y regeneración de la planta.

Cultivo de óvulos

El cultivo de óvulos es una técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo, como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de zigotos y proembriones.

Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar.

Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies. El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.

El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.