La crioconservación de plantas es un
proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo
plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de
–196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación
de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de
preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no
altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo
y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma
vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por
completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos
que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma
vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener
una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez
de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.
El elemento fundamental de la
crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales
herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy
lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro
y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por
lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de
fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que
tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.
Existen dos métodos de conge-lación.
Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.
o
El método de congelación lento, también llamado
método convencional de precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470], consiste en
someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10 ºC hasta –30
ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede realizarse
bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5 ºC/5 min), o
bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este último sistema
mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura aparentemente
continua.
o
En el método de congelación rápido o simple, el
material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente
al NL.
Para evitar los daños celulares se recurre generalmente al uso de
crioprotectores. Los crioprotectores son sustancias de diferente composición
(DMSO, glicerol o etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar,
protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir,
van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular.
Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo
los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los procedimientos en que
se utilizan crioprotectores, el material se somete frecuentemente a
pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la vitrificación. El
método de encapsulación-desecación fue desarrollado por primera vez por Fabre y
cols. [1991, Cryoletters
11: 413-426] para ápices de Solanum
plureja y consiste
básicamente en envolver el material en una cuenta de alginato y,
posteriormente, someterlo a desecación, como por ejemplo, usando gel de sílice,
antes de introducirlo en el NL. En el método de vitrificación [Sakai y cols., 1990, Cryobiology 27: 657; Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470; Sakai y cols., 1991, Plant Science 74: 243-248] se utilizan
combinaciones de agentes protectores, como DMSO, glicerol y etilenglicol, a
diferentes concentraciones para proteger el material, ya que las combinaciones
de agentes protectores son más eficaces que la utilización de cualquier agente
en solitario. Una de las mezclas más utilizadas es: DMSO al 1 %, etilenglicol
al 1 %, y glicerol al 30 %, o bien, DMSO al 5 o 10%, glicerol al 5 o 10 % y
sacarosa.
Bibliografia
- http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm
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