Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo. El medio de cultivo está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener, una planta completa, o un órgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algún agente gelificante.
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25°C).
Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solución correspondiente pero 1 N.
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.
6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución
y fecha de preparación.
Si se presenta algún inconveniente que impida su inmediata esterilización, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.
Ejemplo: Preparar 500 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x, añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.
Formula para utilizar ciertos ml de la solución de 50x y verterlo para hacer 500 ml.
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Datos
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Sustitución
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V1
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500 ml
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V2: V1 C1/C2; V2: 500 ml x 1x / 50x= 10 ml de solución stock
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C1
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1x
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V2
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¿
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C2
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50x
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Phytagel
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2.8 g/L
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2.8 g/L x 500 ml / 1000 ml= 1.4 g/500 ml
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Sacarosa
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30
g/L
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30 g/L x 500 ml /
1000 ml= 15 g/500 ml
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Después de haber agregado las 5 soluciones stock en el matrazas. se agrega después la sacarosa agregando 100 ml de agua, con forme se agrega la sacarosa. Después aforar a 500 ml, después se regula el pH entre 5.6 y 5.8 utilizando HCL o KOH para subir o bajar el ph. después se agrega el Phytagel, se calienta a 40 °C, Aquí puede agregarse el Phytagel, se deja hervir por 2 minutos, después se saca y enfría poco a poco y se agrega a cada frasco con una cantidad a 20 ml.
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